夏铭崎 赵建增
华威特(北京)生物科技有限公司


    摘要:使用猪瘟兔化弱毒株(C株)疫苗能有效地控制猪瘟。但我国已实施大面积强制免疫多年,猪瘟免疫失败却仍时有发生。根据现在执行的猪瘟疫苗制造与检验办法,猪瘟脾淋苗、猪瘟原代细胞及猪瘟传代细胞苗三类商品化弱毒疫苗在制造和检定中可能在原材料的纯净度、疫苗抗原剂量的设计及疫苗的稳定性几个环节仍有潜在的质量管理风险存在,这些因素会影响到防疫方案的设计与实施。认识并避免这些问题的发生可以科学提高猪瘟防疫的质量。


    猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种严重危害养猪业的急性、烈性和接触性传染病,可引起猪的高热稽留、全身广泛性出血、母猪繁殖障碍等一系列症状[1]


    免疫疫苗是控制本病的有效手段。20世纪50年代,我国学者通过将猪瘟石门系强毒在兔体上连续传代数百代后成功培育出猪瘟兔化弱毒疫苗株(Chinese strain,C-strain),取得了猪瘟防疫划时代的突破。该疫苗毒可同时诱导体液免疫和细胞免疫应答,诱导产生完全的临床保护和“病毒学”保护[2,3],对不同基因型的CSFV野毒均能提供有效的保护[4,5]。很多国家借助C株疫苗成功消灭了猪瘟[6]。但在我国,大面积强制免疫并没有有效控制猪瘟流行,许多地区仍发生不同程度的猪瘟疫苗免疫失败,临床伴有发病温和、带毒率高、持续感染等现象,个别地区甚至偶尔会出现暴发性感染[7]


    影响猪瘟疫苗免疫效果的因素众多,除了猪群的健康状况外,生产中仍有来自疫苗质量方面的因素在影响猪瘟免疫效果。本文谨就猪瘟疫苗生产及其质量控制进行简要的论述。


    一、评价猪瘟疫苗质量的关键技术指标


    对于疫苗产品,影响其效力的技术指标主要包括制备疫苗所使用的菌(毒)株、抗原剂量、抗原纯度、抗原稳定性等因素,灭活疫苗的效力还受所使用佐剂的影响。制备时使用的毒(菌)株的抗原性决定其诱导的免疫力是否能够对抗流行病原体。刺激免疫应答需要一定量的抗原,过低不足以刺激有效的免疫应答,过高则可能会导致免疫麻痹。生产和使用方案均需要考虑合理的抗原剂量。疫苗中污染其他病原体会给猪群造成新的疾病,会损害猪的免疫应答能力,还可引起应激反应,因而在生产和使用疫苗时均需要重视抗原的纯度。如果疫苗的稳定性不过关,疫苗在运输与保存过程中,其抗原剂量会不断下降而达不到预期的效力水平。


    二、猪瘟疫苗的种类及特点


    影响猪瘟疫苗质量的技术因素主要包括生产与检验两个方面。不同生产工艺制备的疫苗其抗原含量不同,生产工艺中影响疫苗效价的因素主要包括病毒对易感动物或细胞的适应性,病毒培养条件的优化,原辅材料的纯净性,冻干工艺等。应用不同检验方法对猪瘟半成品及猪瘟疫苗进行检验,检测方法的稳定性、可靠性、可重复性则直接决定了疫苗的品质。


    我国现在使用的猪瘟疫苗基本上全部由C株疫苗毒制备。根据抗原生产工艺不同,可把生产应用的疫苗划为三类:猪瘟脾淋苗、猪瘟原代细胞苗、猪瘟传代细胞苗。


    猪瘟脾淋苗系用猪瘟兔化弱毒株接种家兔,选择定型热和轻热反应兔,从体温下降及其以后的24小时内剖杀,以无菌手术采取脾脏和淋巴结(简称脾淋),制成乳剂,加适宜稳定剂,经冷冻真空干燥制成[8]。脾淋苗免疫原性良好,但疫苗质量受兔源影响较大,对家兔品种、体重、健康状况有严格要求。近年来由于受兔源限制,生产厂家难以选择到优质大耳白兔,应用其他品种兔源制备脾淋毒,难以产生定性热或轻热反应。脾淋苗难以批量化生产,易污染杂菌、感染外源病毒,疫苗批间差异大,如果在生产中混入其他兔体组织,易引起严重的过敏反应。


    猪瘟原代细胞苗系用猪瘟兔化弱毒株接种犊牛睾丸或羔羊肾原代细胞培养,收获细胞培养物,加适宜稳定剂,经冷冻真空干燥制成[8]。猪瘟原代细胞苗相对于脾淋苗易于规模化生产。它需要选用非猪瘟疫区,无口蹄疫、黏膜病等传染病地区的1~4日龄健康小公牛睾丸或10日龄以内的健康羔羊肾细胞制备[8],但在我国牛群中BVDV(牛病毒性腹泻)带毒率高,制备疫苗需要的原代细胞来源并不充裕。如果应用感染BVDV的原代细胞制备猪瘟细胞苗,可使免疫猪感染BVDV,出现腹泻、流产等症状。另外,病毒在原代细胞上适应时间短,复制效率低,难以制成高效价的猪瘟细胞苗。


    采用猪睾丸传代细胞系或牛睾丸传代细胞系增殖猪瘟病毒[9]系最有效的猪瘟抗原病毒制备方法,国际上通常也采用此法制备猪瘟疫苗。猪瘟弱毒疫苗在这两种传代细胞系稳定高效复制、可避免被BVDV等病原污染,能满足我国当前复杂的猪瘟防疫需要。


    三、猪瘟疫苗效力检验方法


    猪瘟病毒对生产和检验细胞不产生细胞病变(nCPE),这给猪瘟疫苗的效力检验带来了一定的困难。进行效力检验的方法有三种:猪效检法、兔效检法、FAID50(50% fluorescent antibody infective dose)法测定。
猪效检法系根据实验免疫猪对强毒攻击的保护情况来确定疫苗的效力。将稀释疫苗肌肉注射5头猪瘟抗体阴性的健康易感猪,10~14日后连同对照猪5头肌肉注射攻击猪瘟石门系血毒。结果对照猪应全部发病,且至少死亡3头;免疫猪全部健活或稍有体温反应,但应无猪瘟临床症状[8]。能保护全部免疫猪存活且无临床发病,即视为疫苗合格。用猪进行效力检验是猪瘟疫苗效力检验方法的金标准,但是需要采用石门系血毒进行检验,而猪瘟强毒的使用存在极大的生物安全风险,一旦出现向猪群的扩散,可能会导致猪瘟大面积爆发。由于它对动物设施要求严格,毒种的取得也比较困难,费时费力,成本高,目前大多数生产企业很少用此法做猪瘟疫苗效力检验。


    兔效检法系根据实验兔对疫苗的热反应来确定疫苗病毒抗原的剂量。将疫苗稀释后接种家兔,接种后,上、下午各测体温1次,48小时后,每隔6小时测体温1次,根据体温反应和攻毒结果进行综合判定。当2只兔均呈定型热反应(++),或1只兔呈定型热反应(++)、另1只兔呈轻热反应(+)时,疫苗判为合格[8]。受兔源品种、体重、健康状况、个体差异及保定方法等影响,部分家兔不易产生定型热或轻热反应,或易出现其它无法判定的情况。所以,兔效力检验法允许重复检验,总检验次数可不超过3次。只要3次内任何一次检验结果成立,该批疫苗检验即算合格。目前市面上流通的猪瘟疫苗均采用此方法进行效力检验。


    FAID50测定是指应用免疫荧光方法对病毒半数组织感染量进行测定的一种方法。把猪瘟疫苗毒按不同的稀释度接种到传代细胞上增殖,通过荧光色素标记抗体与细胞表面及细胞浆内的猪瘟抗原结合后,置荧光显微镜下观察,细胞浆中出现特异性绿色荧光为病毒阳性。中华人民共和国农业部第2270号公告已在《高致病性猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟二联活疫苗(TJM-F92株+C株)制造及检验试行规程》中确认FAID50为猪瘟疫苗部分效力检验方法。应用本法可对猪瘟病毒在细胞水平进行更准确的定量,因而在制备疫苗的过程中根据需要随时定量,进行质量控制。一般在配苗前综合考虑猪瘟抗原半成品病毒含量、疫苗保存期末剂量要求、冻干过程中及保存期可能的抗原剂量损失等因素,通过特定公式计算确定每批疫苗所需猪瘟抗原液用量,这样可以确保每批产品在保存期内的剂量在预期的标准范围内,减少产品批间差。使用这一技术可使猪瘟疫苗质量达到国际水平。


    四、冻干保护技术


    疫苗的临床效力与出厂后疫苗抗原稳定性有很大的关系,冻干保护剂的组成决定了疫苗的稳定性,进而影响到疫苗的效价和质量。掌握生物稳定技术,不但能帮助控制产品质量,还可提高对产品性能判断的可靠性,为制订临床应用方案提供依据。我国现阶段常用的生物制品保护剂主要为蔗糖脱脂牛奶和明胶,其对产品的保护能力不充分,因而要求相应制品于低温保存(-15℃),给兽用生物制品的保存、运输、使用等带来许多困难和不便。生产中许多免疫失败可能源于疫苗在保存或运输过程中效价降低,因而可以说,冻干保护剂是一个关乎当前我国兽用疫苗质量的关键技术。


    近年来我国已加大对耐热冻干保护剂的研究,耐热冻干技术迅速提高,部分已达到发达国家的水平。科学的耐热冻干保护剂更周到地考虑了在较高温度和较长时间保存时可能的物理和化学变化及这些因素对冻干活疫苗活性的影响,比传统冻干保护剂更能有效地保护疫苗,保存时间更长久,可将普通冻干疫苗的保存温度由-15℃提高到2~8℃,且保存期达到18个月以上。解决了成品疫苗由于保存或运输原因引起的效价降低甚至失效问题。


    五、免疫方案与疫苗质量的关系


    在我国,由于原有生产工艺与检验方面存在上述一些技术瓶颈,导致猪瘟疫苗的长期应用方案出现一些变化。例如,在临床应用中常出现任意加大猪瘟疫苗免疫剂量的情况,少则一头猪注射4头份猪瘟疫苗,多则甚至有一头猪注射几十头份或上百头份猪瘟疫苗,而实际注射入猪体内的抗原量是多少不得而知。究其原因,长期的免疫不足导致各阶段的猪群出现了多方面的潜在问题。母猪免疫不足导致仔猪的免疫方案不确定、不均一,全群的免疫不足导致野毒隐性感染增加,形成继发感染等链索问题。通过对猪瘟抗原进行准确定量,对猪瘟疫苗生产与检验各个环节进行严格把关,消除了猪瘟免疫失败的第一诱因,通过精细化的免疫监测及时优化免疫和防疫方案,通过免疫在区域猪群中彻底净化猪瘟不再是梦想。


参考文献:
[1] Moennig, V., Introduction to classical swine fever: virus, disease and control policy. Veterinary microbiology, 2000, 73: 93-102.
[2] Biront, P., et al. Inhibition of virus replication in the tonsils of pigs previously vaccinated with a Chinese strain vaccine and challenged oronasally with a virulent strain of classical swine fever virus. Veterinary microbiology, 1987, 14: 105-113.
[3] Dahle, J., et al. Assessment of safety and protective value of a cell culture modified strain "C" vaccine of hog cholera/classical swine fever virus. Berliner und Munchener tierarztliche Wochenschrift, 1995, 108: 20-25.
[4] Tu, C., et al. Phylogenetic comparison of classical swine fever virus in China. Virus research, 2001, 81: 29-37.
[5] Vandeputte, J., et al. Classical swine fever: the European experience and a guide for infected areas. Revue scientifique et technique, 1999, 18: 638-647.
[6] Vandeputte, J., et al. Classical swine fever: the European experience and a guide for infected areas. Revue scientifique et technique, 1999, 18: 638-647.
[7] 杜念兴. 猪瘟的回顾与展望. 中国畜禽传染病,1998,5,317~319.
[8] 中华人民共和国兽用生物制品规程,二OOO年版,中华人民共和国农业部。
[9] 兽用生物制品质量标准汇编(2012),中国兽医药品监察所、农业部兽药评审中心组编,中国农业出版社。


2016年03月28日

猪瘟免疫与有效防控
猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟二联活疫苗获国家发明专利

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